摘要

目的：比較生化與分子生物學(xué)兩種方法對壞的蠵龜?shù)拔⑸锓N群的鑒定。

方法與結(jié)果：對兩種生化方法（API和Microgen）與一種分子生物學(xué)方法（16S rRNA序列分析）在成本、鑒定、其它方法的數(shù)據(jù)確證、便于使用、資源和軟件等方面進(jìn)行比較。

結(jié)果，分子生物學(xué)方法是昂貴的，并且經(jīng)過測試相對于采用API方法的74%只有66％的分離率被識別。一個74%的鑒定差異發(fā)生在API與16S rRNA分析之間。而兩個生化鑒定方法成本可相媲美，但Microgen更容易使用，并且與API 20E和API 20NE聯(lián)合使用結(jié)果相比較，所產(chǎn)生的鑒定差異是最小的（29%）。

結(jié)論：Microgen識別系統(tǒng)似乎比API或16S rRNA序列分析更適合用于鑒定蠵海龜?shù)爸械奈⑸锓N群。

研究的意義和影響：

大多數(shù)的鑒定方法并不用于微生物的環(huán)境分離。而鑒定系統(tǒng)的相互比較將為生態(tài)學(xué)研究中環(huán)境細(xì)菌的鑒別提供更好的選擇方法。

簡介：
蠵海龜是最常見的海龜種，筑巢于格魯吉亞且部分嗜溫的種群分布于美國(Bo-wen and Karl 1997)。雖然全球范圍內(nèi)蠵海龜?shù)钠骄趸晒β蚀笥?0%(Miller 1997)，但于2006年蠵海龜在全格魯吉亞的孵化成功概率只有63%。而在吉柯島，一個格魯吉亞的最南端的屏障島嶼，在2006年的產(chǎn)卵季節(jié)，孵化成功率只有52.5％(Dodd and Mackinnon 2006)。

在2004年，我們發(fā)起了一個長期的研究，探討蠵海龜?shù)暗淖冑|(zhì)和蛋胚胎死亡過程中微生物污染的潛在作用。迄今為止很少有研究鑒別出與未孵化的海龜?shù)跋嚓P(guān)的微生物(Wyneken et al.1988;Girondot et al.1990;Mo et al.1990)。

在2004,2005和2006年的8月和9月期間，從巢里收集蠵海龜?shù)啊暮｝數(shù)巴獗砻媸占奈⑸锓N群與從胚胎液體中分離的微生物種群相比較。初步結(jié)果表明，微生物污染可能會在海龜?shù)皦乃乐邪l(fā)揮作用，腸道病原體可能會導(dǎo)致胚胎死亡(Cravenet al.2007)。在我們3年的研究中，利用了幾種方法來鑒定分離細(xì)菌。在這份報告中，我們評估了三種不同的常用于環(huán)境細(xì)菌鑒定分離方法的表現(xiàn)。

目前用于檢定與識別細(xì)菌分離株的方法包括各種常規(guī)的表型，生化，酶和分子生物學(xué)檢測(Krieg 1994;Smibert and Krieg 1994;Baron et al.1995;Miller andO’Hara 1995)。利用表型和生化檢驗(yàn)用于細(xì)菌的鑒定是多年的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)。這些測試系統(tǒng)的數(shù)量近年來得到了增長。目前，有許多商業(yè)化的多重測試系統(tǒng)可供使用。生化系統(tǒng)在傳統(tǒng)上一直用于鑒定如弧菌和腸桿菌科成員的特定臨床病原體。盡管有些研究顯示出與這些鑒定系統(tǒng)相關(guān)的高精確率報導(dǎo)(Sogaard et al.1986;O’Hara et al.2003;Croci et al.2007)，但一些另外的研究卻報導(dǎo)出了這些系統(tǒng)不太令人滿意的病原體鑒定結(jié)果。(Israil et al.2003;Colodner et al.2004;Martinez-Urtaza et al.2004)。此外，因?yàn)榄h(huán)境細(xì)菌在計算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫信息不足，基于生化反應(yīng)的鑒定系統(tǒng)可能無法可靠地對環(huán)境細(xì)菌分離鑒定。

近年來，分子生物學(xué)方法已用于微生物的常規(guī)鑒定，或作為豐度，多樣性和系統(tǒng)發(fā)育研究的直接措施(Krieg 1994;Gevers and Coenye 2007;Liu and Stahl 2007)。常見的方法包括核酸序列修復(fù)的使用，基因組DNA雜交，核酸指紋和核酸擴(kuò)增。雖然分子生物學(xué)方法已被證明是非常敏感的，但他們有自己的局限性。核酸擴(kuò)增程序能夠確定特定微生物的DNA或RNA是否在目前的樣品中，但不能確定生物體的生存能力。分子生物學(xué)的方法總是局限于細(xì)菌數(shù)據(jù)庫大小的程度，而且往往需要復(fù)雜的程序，訓(xùn)練有素的人員和昂貴的專用設(shè)備。

在我們的第一個3年的研究中，針對環(huán)境分離鑒定的微生物，我們比較和評估了三個不同的方法：生物梅里埃（API 20E）和（API 20NE）識別系統(tǒng)(Biomerieux,Marcy l’Etoile,France;www.industry.biomerieux-usa.com)，Microgen的GNA和GNB生化檢測試劑盒(Microbiology International,Surrey,UK;www.microgenbioproducts.com)，和Accugenix的16s rRNA 基因的遺傳分析(Accugenix,Newark,DE,USA; www.acugenix.com)。考慮的因素包括識別的能力，與其他方法的確證，成本，易用性，指示系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)資源，并提供的數(shù)據(jù)庫/計算機(jī)軟件。，因?yàn)槭欠穹蛛x到腸桿菌科的不確定性，所以API 20E和API20NE同時使用。據(jù)推測，來自雌性海龜陰道的腸道致病菌可能會在產(chǎn)卵期間轉(zhuǎn)移到海龜?shù)爸小icrogen的檢測試劑盒作為一種替代測試。因?yàn)樗麄儾⒉恍枰獌蓚€單獨(dú)的鑒別（腸道和非腸道）檢測。

材料和方法：
海龜?shù)笆占?/span>

在2004，2005和2006年的8月和9月期間，從11個烏龜巢中共收集70只未孵化的，完整的蠵海龜?shù)啊Ｋ械某捕荚诿绹糁蝸喖聧u上完成孵育。海龜?shù)暗氖占谟左w出現(xiàn)后的3-5天后進(jìn)行，或開始孵化的70天后（足月孵化為60-70天）。海龜?shù)埃ê透C里的沙一起）被收集到儲存于室溫下的無菌紙袋中存放，并運(yùn)往美國佐治亞州，薩凡納，阿姆斯特朗大西洋州立大學(xué)進(jìn)行處理。海龜?shù)暗募庸ぬ幚磉^程在2~4小時之內(nèi)完成。來自健康的巢穴（受控巢穴）的蛋不能被收集，因?yàn)檫@與受到威脅的物種--海龜是對立的。

細(xì)菌的分離和鑒定
每個巢隨機(jī)抽取3~6個海龜?shù)坝糜诩?xì)菌的分離。接著，除去蛋表面的巢沙。使用無菌棉簽轉(zhuǎn)移和分離的蛋表面的細(xì)菌。為了確定與胚胎液相關(guān)的細(xì)菌群體，蛋首先浸沒在過氧化氫中5分鐘，接著浸入95%乙醇中3分鐘以消毒。再用聚維酮碘消毒蛋的表面，用無菌剪刀和鑷子移除一塊蛋殼。
用無菌棉簽或無菌巴斯德吸液管來獲取胚胎流體樣品。被分離的細(xì)菌使用區(qū)域劃線隔離技術(shù)，生長在（TSA）和（ＭＡ）培養(yǎng)基上，30℃下、24~48 h。分離的細(xì)菌均保存在TSA和ＭＡ瓊脂斜面上。革蘭氏染色使用Hucker染色法、孢子染色使用謝弗弗爾頓染色法（Murray等al.1994）。

生化方法

分離株的生化鑒定使用市售的微型多測試識別系統(tǒng)：API（Biomerieux）及Microgen（Microbiology International）。接種每個鑒定系統(tǒng)之前，每個分離株都來自于一個24h TSB培養(yǎng)后重新接種到TSA平板上獲得的用于測試目的單獨(dú)菌落。

API 20E
    API 20E鑒定系統(tǒng)是專為鑒定腸桿菌科細(xì)菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性菌成員的測試條。
測試條根據(jù)提供的說明進(jìn)行接種和培養(yǎng)。無菌0.85％鹽溶液作為陰性對照，而變形桿菌作為陽性對照。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定，并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

API 20NE

API 20E鑒定系統(tǒng)是專為鑒定非苛養(yǎng)，非腸道革蘭氏陰性菌成員的測試條。根據(jù)提供的說明進(jìn)行接種和培養(yǎng)。無菌0.85％鹽溶液作為陰性對照，而綠膿桿菌作為陽性對照。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定，并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

API CHB/E
API CHB/E鑒定系統(tǒng)是用于鑒定芽孢桿菌及其相關(guān)屬。它還用于屬于腸桿菌科細(xì)菌的革蘭氏陰性桿菌和弧菌家族的鑒定。測試條根據(jù)提供的說明書來接種與培養(yǎng)。采用API網(wǎng)絡(luò)軟件進(jìn)行鑒定，并且當(dāng)鑒定結(jié)果符合率在80%或更好時被認(rèn)為是可以接受的。(Biomerieux)。

Microgen GN A and GN B
Microgen GN A是最常遇到的腸桿菌科成員12種反應(yīng)底物固化的鑒定系統(tǒng)。GN A + B系統(tǒng)是目前公認(rèn)的非發(fā)酵，革蘭陰性桿菌，加氧化酶陰性腸桿菌科的所有物種的綜合識別系統(tǒng)。它還確定了11個屬的氧化酶陽性，不苛養(yǎng)，革蘭陰性桿菌屬。測試條根據(jù)說明書提供的指示來接種和培養(yǎng)。對于這兩項(xiàng)GN A和GNA+B測試，采用無菌0.85％生理鹽水作為陰性對照。而大腸桿菌和變形桿菌被用來作為陽性對照。鑒定結(jié)果通過使用Microgen鑒定系統(tǒng)獲得。

分子生物學(xué)方法
27個隨機(jī)挑選的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株挑染到TSA平板上，然后轉(zhuǎn)接到微生物鑒定Accugenix上。Accugenix的鑒定系統(tǒng)是基于16S rDNA序列和自動化核糖分型（Accugenix2007年）的聯(lián)合。用于遺傳分析選定的分離菌株均來自從2005年筑巢季節(jié)期間收集的海龜?shù)爸小?/span>

結(jié)果

API與Microgen的比較

比較采用31株菌株API與Microgen的鑒定情況，API 20NE系統(tǒng)鑒定了28株（90%），API 20E系統(tǒng)鑒定了18株（58％）和Microgen系統(tǒng)鑒定了31株（100%）（見表1）。
然而，只有65％的菌株經(jīng)由API 20NE系統(tǒng)和26％菌株經(jīng)由的API 20E系統(tǒng)鑒定分離被認(rèn)為是可接受的（鑒定概率等于80％或更高）。同樣，雖然100％的菌株經(jīng)由Microgen確定，但也只有68％的鑒定是（高于80%）可以接受的。相比較結(jié)果，在API 20NE與Microgen之間產(chǎn)生了一個52%的鑒定差異，而在API 20E與Microgen之間產(chǎn)生了78%的鑒定差異。然而，當(dāng)Microgen的數(shù)據(jù)API20NE和API20E合并后的數(shù)據(jù)相比，這種鑒定差距下降到38％，即確定了12株由Microgen識別而API20NE或API20E兩者之一單獨(dú)無法鑒別的菌株被鑒定。仔細(xì)觀察顯示一直有差異的12個菌株的鑒定數(shù)據(jù)，兩個API的數(shù)據(jù)庫對其中的3株菌株表現(xiàn)出完全沒有數(shù)據(jù)。考慮到這一點(diǎn)，Microgen的結(jié)果和聯(lián)合的API結(jié)果之間的差異，下降到29％。Microgen的鑒定，因此，配合API的兩個測試最終可以鑒定71％的菌株。API 20E和API 20NE之間的鑒定差異是比較高的（83％）。綠膿桿菌和蒼白桿菌是唯一經(jīng)由 API20NE和API20E同時鑒定的菌株。通過兩種方法正確的操作鑒定過程是嚴(yán)受到格控制的。

API 與Accugenix的比較

相比較API和Accugenix用于革蘭氏陰性菌株的鑒定，API鑒定了86%的測試菌株，而Accugenix只鑒定了66%（見表2）。API鑒定系統(tǒng)能夠識別所有的測試菌株到屬、種的水平。而通過Accugenix鑒定的66%的菌株中，86％被確定到種，14％只能確定到屬。通過Accugenix系統(tǒng)，共有7株菌株不能被識別，其中四株給出了匹配為最接近可能的鑒定結(jié)果，而另三株則完全無法識別。API與Accugenix鑒定結(jié)果的比較產(chǎn)生了出了72％的鑒定差異。菌株J66UH2F4通過APi鑒定為:嗜麥寡養(yǎng)單胞菌，而通過Accugenix鑒定為:彎曲假單胞菌。通過審查表型分支樹表明，這兩種生物體的密切相關(guān)性只有（1.52%）。而當(dāng)不能給出鑒定數(shù)據(jù)時，Accugenix將提供最接近的相關(guān)鑒定。但在所有情況下，即使是最接近的鑒定結(jié)果也無法與API的鑒定結(jié)果相吻合。

表1：革蘭陰性桿菌的細(xì)菌鑒定：API（20E和20NE）VS Microgen

*：未在Mirogen的數(shù)據(jù)庫中。
！：未在API的數(shù)據(jù)庫中。

對于革蘭氏陽性菌株，API只能鑒定出6株測試菌株中的2株（33%）（表3）。而Accugenix鑒定出了全部的6株。但其中一株[J66UH3OS（1）]產(chǎn)生了多重的鑒定結(jié)果，并且另外還有三株只能被鑒定到屬的水平（表3）。總體而言，相比較于Accugenix系統(tǒng)的檢出率70%（單獨(dú)菌株被檢出多重的鑒定結(jié)果被視作為：NO ID），API系統(tǒng)對于總測試菌株樣品檢出率達(dá)到了74%。最大的差異發(fā)生于革蘭氏染色陽性菌株鑒定中，數(shù)據(jù)結(jié)果的比較在兩種檢測方法之間產(chǎn)生了一個74%的差異。通過兩種方法正確的操作鑒定過程是受到嚴(yán)格控制的。

討論
    在試圖確定將來自壞死蠵海龜?shù)爸协h(huán)境細(xì)菌的分離鑒定最有效果和有效率的方法，我們比較和評估了一項(xiàng)為期三年跨度的三個細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。在我們研究的第一年，細(xì)菌分離株通過使用API 20E、API 20NE與API CHB/E鑒定系統(tǒng)來鑒定。API系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于整個美國并且作為一項(xiàng)“金標(biāo)準(zhǔn)”被其它的鑒定系統(tǒng)作為比較對象。雖然，已有眾多的研究針對臨床菌株進(jìn)行了API與其它市售鑒定系統(tǒng)的比較，但只有少數(shù)研究進(jìn)行了環(huán)境中分離株的API與其它方法的鑒定比較。(Brown and Leff 1996;Johnsen et al.1996;Toti et al.1996; Truu et al.1999;Israil et al.2003)。為了確定的API系統(tǒng)用于鑒定與蠵海龜?shù)跋嚓P(guān)聯(lián)的環(huán)境細(xì)菌的作用，我們用API與其它的鑒定系統(tǒng)做了比較。由于涉及16S rRNA基因測序的分子生物學(xué)方法，現(xiàn)在經(jīng)常使用的細(xì)菌鑒定，從第二年數(shù)據(jù)分離株隨機(jī)被取用于16S rRNA序列分析鑒定與API系統(tǒng)相比較。
 

表2：革蘭陰性菌株的細(xì)菌鑒定：API（20E和20NE）VS  Accugenix

表3：革蘭氏陽性菌株的細(xì)菌鑒定：API（CHB/E） VS  Accugenix

作為一個額外的比較，我們拿API與另一個較新的生化系統(tǒng)（Microgen GN A和GNB鑒定試劑條）進(jìn)行對比，在我們研究的第三個年頭。當(dāng)比較和評估這三種方法時，以下的因素都被考慮：鑒定分離株的能力、用其他方法確證數(shù)據(jù)、成本、易用性、網(wǎng)絡(luò)資源/指令、和數(shù)據(jù)庫/計算機(jī)軟件。 

鑒定分離株的能力和用其他方法確證鑒定
    由于使用未知的環(huán)境分離株其鑒定的準(zhǔn)確性難以確保，我們在鑒定方法之間通過他們鑒定分離菌株的能力以及鑒定的證據(jù)來評估我們的所使用的方法。在API與Accugenix方法之間進(jìn)行數(shù)據(jù)的比較，得出了一個高水平的差異（74%）。總的來說，這兩種方法在鑒定分離株（API的74％；Accugenix 70％）方面可以相媲美，，但用來識別革蘭氏陰性VS革蘭氏陽性分離株時，存在性能上的差異。API能夠鑒定更多的革蘭氏陰性分離株（86%）相比較Accugenix的（66%）。但是Accugenix能夠鑒定更多的革蘭氏陽性菌株（100%）相比較API的（33%）。

高水平的API和Accugenix鑒定之間的差異是難以解釋的，但可能是因?yàn)槿狈Νh(huán)境分離株數(shù)據(jù)庫中的收錄信息部分。純培養(yǎng)過程不是可能引起樣品鑒定差異的原因。因?yàn)榫暌恢北惶羧『椭匦路蛛x以保持純度。
    API 20E和API 20NE系統(tǒng)鑒定86％的革蘭陰性分離株相比API CHB/ E系統(tǒng)，只有33％的革蘭氏陽性分離株被鑒定。這表明，API 20E和API 20NE系統(tǒng)進(jìn)行鑒定環(huán)境分離株比API CHB/ E系統(tǒng)更好。由于API CHB/ E系統(tǒng)是專門設(shè)計來鑒定芽孢桿菌和相關(guān)屬的，這也許可以解釋一些差異和低識別率觀察。

API 20NE、API 20E和Microgen比較表明Microgen可能是一個更可靠的系統(tǒng)。Microgen鑒定了所有分離菌株（100％）與API的20NE和20E聯(lián)合使用鑒定了（90％）相比。此外，71％的API 20E和API 20NE相結(jié)合的菌株鑒定數(shù)據(jù)被Microgen鑒定所證實(shí)。Microgen高的鑒定百分率可以歸因于Microgen的編號系統(tǒng)提供一個更廣泛的數(shù)據(jù)庫。雖然API 20E和20NE系統(tǒng)的設(shè)計，主要用于臨床和食品分離株使用，Microgen的數(shù)據(jù)庫中聲稱，結(jié)合臨床，食品，環(huán)境和獸醫(yī)數(shù)據(jù)。不完整的數(shù)據(jù)庫，也可考慮為差異的一個部分。例如，鞘脂桿菌屬 spiritivorum和蒼白桿菌屬 anthropi不是Microgen的數(shù)據(jù)庫中的一部分，和放線菌屬，不是API的數(shù)據(jù)庫中的一部分。

 正如預(yù)期的那樣，我們的數(shù)據(jù)表明，API 20NE比API 20E能更好地適應(yīng)鑒定環(huán)境分離株。Toti等人（1996年）和Israil等人（2003）也指出，針對環(huán)境樣品的分析，API的20NE系統(tǒng)比API20E系統(tǒng)提供了一個更高分辨率的正確鑒定。API系統(tǒng)的限制是一個不爭的事實(shí)
，革蘭陰性桿菌的鑒定需要確定是否腸道或非腸道分離菌的信息支持。如果沒有這些信息，環(huán)境分離株需要的API20E和API20NE系統(tǒng)各自的性能去鑒定。兩次測試之間的鑒定差異經(jīng)常出現(xiàn)，互相混淆，尤其是當(dāng)每個測試標(biāo)識出分離株的一個高百分比概率。而這個問題沒有發(fā)生在Microgen系統(tǒng)上，因?yàn)檫@兩個條旨在配合工作，因?yàn)檫@兩個測試條旨在配合工作，只需其中一個條確證所需鑒定的生物體是否氧化酶陰性。 

成本分析
    估計成本，鑒定一個分離株如下：
API 20E為7.16；API 20NE為$5.66；Microgen GN-A為$3.33；Microgen GNB為$4.17；Accugenix為$ 75.00~$31500根據(jù)周轉(zhuǎn)周期而定?；驕y試與生化鑒定系統(tǒng)相比被證明是非常昂貴的，是不現(xiàn)實(shí)的。在有限的資源條件下。Microgen系統(tǒng)的研究方案是較API系統(tǒng)便宜的，但如果API系統(tǒng)可獲得折扣，便可使這兩個系統(tǒng)的成本可比。

易于使用
    試劑盒的研制，接種準(zhǔn)備，接種程序比較表明，Microgen比API系統(tǒng)更容易使用。Microgen測試條相比較API的測試條，減少了它約一半的準(zhǔn)備和接種的時間。Microgen（Microgen的一個培養(yǎng)溫度相比較API設(shè)置的2個培養(yǎng)溫度），培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)也簡單。分子生物學(xué)使用方法不包括在這次比較中，因?yàn)榫觇b定實(shí)驗(yàn)不是在我們的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的。

說明/ Web資源
總體而言，Microgen的說明書和網(wǎng)絡(luò)資源比API的信息更詳細(xì)，更易于使用，并提供更多的信息。 

API網(wǎng)絡(luò) VS Microgen識別系統(tǒng)
    Api網(wǎng)絡(luò)提供物種鑒定和表型概率的索引（配置文件的字符）。它總是一個完整的生物化學(xué)檢測清單，和1至4個額外的測試組成。Microgen ID軟件提供在線的應(yīng)用手冊和連接到Microgen網(wǎng)站的鏈接。該軟件提供五個最可能的鑒定選擇、可能性、鑒定概率、及每一個選擇的分化程度。它還提供了三個異常反應(yīng)和最多五個額外的測試，以便進(jìn)一步區(qū)分。最新的名稱上的變化和分類的起源也包括在內(nèi)。

與所有其它的鑒定方法一樣，測試系統(tǒng)沒有100％準(zhǔn)確或可靠的。測試鑒定系統(tǒng)的局限性包括：不完整的計算機(jī)化的數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫的準(zhǔn)確性，來源菌株進(jìn)行測試（臨床，分子食物或環(huán)境）和核酸的提取方法。

 我們的研究結(jié)果表明，生化代謝分析可以有效地用來識別特定的環(huán)境細(xì)菌分離。雖然所有三種方法細(xì)菌鑒定都是可行的方案，但是生化方法更便宜，更容易使用，提供快速的結(jié)果，不需要使用專門的設(shè)備和分子生物學(xué)方法所需的程序。這是特別重要的，尤其當(dāng)試圖分離和鑒定大量細(xì)菌需要在一個很短的時間內(nèi)完成時。生化方法也允許我們建立一個菌株代謝概況特點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫。McRoy和Seidler（1973年），Siebeling等。（1975年），阿庫納等（1999）和迪亞茲等人（2006）還利用生化檢測，識別與龜相關(guān)的微生物種群。

 系統(tǒng)測試兩個生化方法中，Microgen似乎是最適合用于鑒定海龜?shù)暗沫h(huán)境分離菌株。
API和Microgen成本相媲美，但Microgen系統(tǒng)被證明使用是更簡單的，相比API 20E和API 20NE有最高的確證鑒定比例。微生物學(xué)國際（2002）進(jìn)行的一項(xiàng)研究也指出了類似的結(jié)果。Microgen ID系統(tǒng)是一個相對簡單和成本效益好的用于某些生態(tài)檢測的鑒定系統(tǒng)，非常適合面對小和/或有限的資源的大學(xué)和研究實(shí)驗(yàn)室。